黑種草 V.S.頭頸癌
黑種草百里醌對體外頭頸部鱗狀細胞癌細胞的影響
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5494754/
百里醌（TQ）是黑種草油（Nigella sativa）中存在的主要生物活性成分;它已在各種癌細胞類型中顯示出抗炎和抗腫瘤作用。本研究的目的是分別研究TQ對頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞系的影響，以及它們與輻射和順鉑的聯合作用。 SCC25和CAL27 HNSCC細胞系分別用TQ和與順鉑或放射的組合處理。進行增殖測定和克隆形成測定。通過流式細胞術檢測細胞凋亡。 TQ在所研究的細胞系中通過細胞凋亡表現出劑量依賴性細胞毒性。與順鉑組合，TQ導致細胞毒性沒有顯著增加。結合輻射，與單獨的每種治療方法相比，TQ顯著降低了克隆形成存活率。由於其抗增殖和放射增敏特性，TQ是治療頭頸癌的有希望的藥劑。
介紹
頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是世界上第六大常見癌症類型，每年死亡率超過600,000。在過去的幾十年裡，生存率沒有增加。此外，當前治療策略（包括手術和放化療）的顯著副作用仍然是導致對治療產生不滿的重要因素（3）。已經描述了罕見但危及生命的並發症，例如放療後的血管侵蝕。然而，在晚期疾病的情況下，甚至聯合治療方式也會產生不令人滿意的結果。因此，需要新的治療物質，其增強已建立的療法的已知效果，同時減少不希望的副作用。
百里醌（TQ）是源自黑種草（Nigella sativa）的植物化學化合物。已經在體外和體內進行了廣泛的研究，證明它可以發揮抗腫瘤，抗炎，免疫調節，降血糖，抗高血壓，抗菌，抗寄生蟲和抗氧化作用 。
已經在結腸癌，前列腺癌，胰腺癌和肺癌的腫瘤異種移植小鼠模型中研究了TQ的抗腫瘤作用。通過誘導細胞凋亡，細胞週期停滯，活性氧物質的產生和抗轉移/抗血管生成來介導抗腫瘤活性。涉及的分子靶標包括細胞腫瘤抗原p53，腫瘤蛋白p73，磷酸酶和張力蛋白同源物，信號轉導和轉錄激活因子3，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ和半胱天冬酶的激活（8）。結合這些有希望的抗腫瘤作用，據報導TQ在實驗室動物的急性和慢性毒性研究中是安全的，特別是當口服給藥時。
鑑於這些發現和尋找針對頭頸癌的新型治療方法，進行了本研究。該研究的目的是檢查TQ在兩種HNSCC系SCC25和CAL27中的作用，並研究TQ是否在體外與順鉑和/或放射顯示出協同效應。進行增殖和克隆形成測定，並通過流式細胞術測量細胞凋亡。據我們所知，這是第一項分析TQ聯合順鉑和放射線對HNSCC細胞系的影響的研究。
細胞培養
HNSCC SCC25細胞系獲自American Type Culture Collection（Manassas，VA，USA）。 HNSCC CAL27細胞系獲自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ，Braunschweig，Germany）。如前所述培養腫瘤細胞（10）。簡而言之，細胞在補充有10％胎牛血清（PAA Laboratories，Linz，Austria）和1％青黴素 - 鏈黴素（Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA）的RPMI培養基（Cambrex，Walkersville，MD，USA）中生長。在37℃，5％CO 2的潮濕氣氛中。
細胞活力測定
細胞計數試劑盒-8（CCK-8）細胞活力測定（Dojindo Molecular Technologies，Gaithersburg，MD，USA）用於測定TQ對體外腫瘤細胞的細胞毒性作用。將細胞以每孔3×103個細胞接種到96孔板中並孵育24小時。接下來，用增加濃度的TQ單獨（0-80μM）和/或與遞增濃度的順鉑（0-32μM）組合處理細胞。 DMSO的等分試樣用作對照。培養72小時後，根據製造商的方案通過CCK-8測量細胞增殖。實驗獨立完成至少三次，一式三份進行。
分析組合效應
為了評估TQ與順鉑的可能的協同效應，用增加的兩種藥劑組合（0-40μMTQ和0-32μM順鉑）處理細胞。產生劑量響應曲線並基於Chou-Talalay方程（11）用CalcuSyn？軟件（2.0版; Biosoft，Cambridge，UK）計算相互作用。
放射
使用150kV X射線機（Gulmay D3300; Gulmay Medical Ltd.，Byfleet，UK）在室溫下以2Gy / min的劑量率照射細胞。場尺寸為20×20cm，聚焦物距離為52cm。對於劑量測定，使用熱釋光劑量計。
克隆形成試驗
如前所述進行克隆形成測定（12）。簡言之，將3-15×10 2個細胞接種到6孔板中並使其靜置24小時。然後，將細胞暴露於5-20μMTQ和/或用2,4,6或8Gy照射。 72小時後，用無藥物培養基替換含藥培養基。再過10天后，用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌細胞，用甲醇固定並用亞甲藍染色。將具有> 50個細胞的集落視為存活者併計數。
流式細胞術分析
將總共1×10 5個細胞接種在6孔板中。 24小時後，用增加劑量的TQ（具有0,40和60μM的SCC25;和具有0,20和40μM的CAL27）處理細胞。用40μM順鉑處理的細胞用作陽性對照。使用膜聯蛋白-V細胞凋亡檢測試劑盒（Bender MedSystems，Vienna，Austria）在48小時後測量細胞凋亡。細胞凋亡定義為膜聯蛋白V + /碘化丙啶（PI） - 。膜聯蛋白V- / PI +和膜聯蛋白V + / PI +結果定義了壞死細胞。
統計分析
使用SPSS®版本21軟件（IBM®SPSS，Armonk，NY，USA）和Graph Pad 5.0軟件（PRISM®; GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA）進行細胞活力測定和流式細胞術實驗的統計分析。 ）。為了評估克隆形成存活，根據Franken等人的方案（13）使用線性二次模型。所有實驗重複至少三次。誤差棒表示平均值的標準誤差（SEM），P <0.05被認為表示統計學上顯著的差異。
結果
TQ對細胞增殖的影響
在HNSCC SCC25和CAL27細胞系中檢查TQ的細胞毒性作用。用TQ處理細胞，劑量範圍為0至80μM。 TQ在兩種測試的細胞系中顯示出劑量依賴性生長抑制。在SCC25和CAL27細胞系中，分別在80和40μM下發現用TQ處理後的最大細胞毒性作用。治療72小時後的劑量 - 反應曲線如圖1所示.TQ的半數最大抑制濃度（IC50）值範圍為12.12μM（CAL27）至24.62μM（SCC25），SEM在1.07μM（CAL27）和1.10μM（SCC25）。
TQ與順鉑聯合應用對細胞增殖的影響
研究了TQ和順鉑的聯合作用。首先用含有固定比例（1：1.25）濃度的TQ（0-40μM）和順鉑（0-32μM）的培養基處理細胞。用CalcuSyn®軟件（版本2.0，Biosoft，GB）計算可能的協同效應。組合指數（CI）= 1表示加和效應，CI <1表示協同效應，CI> 1表示拮抗作用。在兩種細胞系中，無法證明協同效應（圖2）。
TQ和輻射對克隆形成存活的綜合影響
為了確定用放射治療的長期效果，進行克隆形成測定。用TQ（具有0,10或20μM的SCC25;和具有0,5或10μM的CAL27）處理細胞，然後用0,2,4,6或8Gy照射。在兩種測試的細胞系中，用TQ和/或輻射處理導致克隆形成存活減少。聯合處理導致集落形成的協同抑制 。
TQ誘導HNSCC凋亡
由於用TQ處理導致癌細胞增殖減少，因此進行流式細胞術測量以評估細胞凋亡的誘導。用TQ（具有0,40和60μM的SCC25;和具有0,20和40μM的CAL27）處理細胞並孵育48小時。用40μM順鉑處理的細胞用作陽性對照。用TQ處理導致凋亡率明顯增加（圖4）。
討論
本研究首次證明了TQ在HNSCC細胞中與放射線結合時的協同作用。實驗表明，與僅使用一種方式的治療相比，聯合治療可以更強烈地抑制長期增殖。這通過克隆形成測定證實，並且可以解釋為TQ的放射增敏作用。該化合物被稱為天然存在的藥劑，在多種腫瘤實體中具有抗增殖作用 。然而，關於輻射聯合治療的文章很少發表。 Velho-Pereira等人研究了人乳腺癌細胞（MCF7和T47D）的聯合作用，並證實了增強的放射敏感性（15）。目前的結果支持這些發現。
在本實驗中，TQ與順鉑組合未顯示出抗增殖協同作用。這在兩個HNSCC細胞系中通過增殖測定證明。這些結果與先前的研究結果不同 。 Jafri等 在體外和在體內使用NCI-H460的小鼠異種移植模型中將TQ與順鉑組合在肺癌細胞系（NCI-H460和NCI-H146）中。該研究描述了聯合治療的協同效應，並得出結論，TQ和順鉑似乎是肺癌中的活性治療組合。然而，體外實驗中使用的TQ濃度（80和100μM）顯著高於本研究中的濃度。在這些濃度下，即使不添加順鉑，本發明的細胞係也幾乎沒有活力。
Attoub等（14）在源自肺（LNM35），肝（HepG2），結腸（HT29），黑素瘤（MDA-MB-435）和乳腺（MDA-MB-）的細胞中用TQ和/或順鉑進行體外實驗。 231和MCF-7）腫瘤，並證明TQ與順鉑協同作用以抑制細胞活力。未研究源自頭頸腫瘤的癌細胞。
在本研究中，TQ作為單一藥物顯示劑量依賴性細胞增殖抑制，在CAL27和SCC25細胞系中72小時後IC50分別為12.12至24.62μM。這表明TQ是一種有效的抗增殖物質。這些值與先前報導的各種癌細胞系中TQ的IC50值一致 。
結論:
本研究表明TQ是一種有效的植物化學化合物，在頭頸癌細胞中具有抗增殖和放射增敏特性。由於其低毒性，TQ可能在未來用作放射治療的輔助劑。
